Sanger测序

擎科生物是中国首家采用以磁珠为依托的半自动测序流程。较传统膜纯化方法，采用磁珠方法大幅提高模板纯度和浓度，有效避免信号弱，信号衰减，甚至无信号的风险，测序成功率为国内领先水平。

服务特色

• 实验基地：全国多个城市都有实验基地，近距离的提供服务。
• 质量可靠：上下游实验均采用磁珠纯化，实验稳定结果更好。
• 快速交付：当日取样，最快次日上午发送结果。
• 测序通量：拥有二十多台3730xl测序仪,可满足大批量测序要求。

送样要求

订单注意事项

• 请详细填写测序样本登记表，避免产生问题订单，以便及时安排实验。
• 送样管上编号请和登记表上一致，样品编号可包含“字母”、“数字”、“—”，请勿出现其他特殊字符。
• 菌液样品需要注明使用抗生素。
• 若需要测序的引物不是通用引物，请单独提供，并标注浓度。
• 若测序样品存在特殊结构，请在订单上备注，如：GC rich、甲基化、复杂结构等。
• 大批量的样品，请提供电子版样品表格。

测序常见问题：

Q-1.测序结果有很多套峰，还照常收费，为什么?

A-1.DNA模板上出现二处以上引物结合位点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成，这些结果会收费。

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Q-2.为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象?

A-2.PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因：

(1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。

(2) 结构上的原因，造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/T G/C以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。

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Q-3.出现套峰的原因是什么？

A-3.在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点：

(1) 测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰。

(2) 模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带。

(3) 模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等。

(4) 引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好。

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Q-4.测序结果不到800 Bases，还照常收费了，为什么?

A-4.如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。 对这些结果，公司会根据具体测序情况进行收费。出现这些情况的原因分析如下：

(1) G/C rich、G/C Cluster：这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失；

(2) A、T的连续结构：这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打滑现象），造成测序结果紊乱，出现套峰。出现这样的情况，建议反向测序。

(3) 原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。

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Q-5.觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？

A-5.出现这样的情况只有两种可能：

(1) 可能是空载体,没有装进去目的片段。

(2) 您的样品插入部分与您预期的不一致。我们无法判断测得的序列是否与您预期的结果一致，我们可以为您做的是，检查发送给您的测序结果与您提供来的样品是否一致。出现您这样的问题，我们常规的做法是进行验证实验。验证实验的方法是取您的原始菌液重新抽提质粒进行测序。验证实验如在可靠范围内结果与前次不同则说明我们前次的测序结果是有问题的，前次测序的费用免除；如结果仍然相同，那么说明前次测序的结果准确，则您还需要支付这一次测序的费用。

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Q-6.测序结果的找不到引物序列？

A-6(1) 如果您提供的是PCR样品，在测序报告上找不到您的引物序列是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没 有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。实际上不但测序引物无法识别，而且由于目前测序技术的局限性，紧靠测序引物一侧的30～50个bp通常也无法100％识别，如果需要验证这个区域的碱基序列或者测序引物本身的序列，就需要用另一侧引物进行反向测序。

(2) 您提供的是质粒或菌液样品,使用通用引物测序，找不到您的PCR引物可能是因为您的PCR引物距离载体的通用引物位点过近，由于测序反应在距离起始位点30-50bp内的结果可信度不高，因此会影响您正确读取您的PCR引物序列。

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Q-7.我有一个长的片段，希望你们帮我测通，还有测通需要的时间。

A-7(1) 长度为1Kb的DNA模板需要两个测序反应，才有可能得到完整准确的读长，对于1.6kb以上的DNA片断，在两个反应后还需要设计合成测序引物，测序后拼接出全长，对于这些测序引物，我们将按碱基个数收取引物合成费用。

(2) 测通需要的时间。

a.如有预期片段的序列，可以一次做设计好引物做出实验方案， 3-5天发送结果；

b.如没有预期的序列，可以从两端设计引物，引物合成时间需要48小时，测序需要48小时。

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引物合成

引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

服务特色

• 实验基地：全国多个城市都有实验基地，近距离的提供服务。
• 快速交付：常规引物当日下单，次日送达（仅满足有实验基地的城市）。
• 质量可靠：严格的质控，所有修饰引物全部采用HPLC纯化。
• 纯化方式可选：可提供OPC(脱盐)、PAGE、HPLC纯化，满足各种实验需求。
• 引物标记：提供各种化学修饰碱基、生物素、荧光标记等（详见修饰引物）。

（一）普通引物合成

普通引物类别：

常规引物：6-59 mer

长链引物：60-150 mer

纯化方式选择：

纯化方式	5～20 mer	21～40 mer	41～60 mer	61～90 mer	91～150 mer	应用
OPC纯化	适用	推荐	推荐	适用	不适用	PCR扩增、亚克隆、点突变、全基因合成及DNA测序等。
PAGE纯化	不适用	适用	适用	推荐	推荐	对40 mer以上的普通引物的纯化，用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析等。
HPLC纯化	推荐	推荐	适用	不适用	不适用	小于50 mer的普通引物的纯化，上述应用及修饰引物的纯化；商业化的诊断引物或探针等。

收费方式：

引物长度	纯化方式	合成量	收费方式
6-15 mer	OPC(脱盐)	1-5 OD	20元/条
	PAGE	1-5 OD	20元/条
	HPLC	1-5 OD	20元/条 + 80元纯化费
16-59 mer	OPC(脱盐)	1-5 OD	1.2元/mer
	PAGE	1-5 OD	1.5元/mer
	HPLC	1-5 OD	1.2元/mer + 80元纯化费
60-90 mer	OPC(脱盐)	1-2 OD	4元/mer
	PAGE	1-2 OD	4元/mer
	HPLC	1-2 OD	4元/mer + 80元纯化费
90-150 mer	OPC(脱盐)	1-2 OD	7元/mer
	PAGE	1-2 OD	7元/mer
	HPLC	1-2 OD	7元/mer+80元纯化费

服务说明

• 未注明合成量，我们将按照总量2 OD，分装2管合成。
• 兼并碱基按照常规引物收费。
• 引物＜15 mer的按条收费，引物＞59 mer的按长链收费。
• 修饰引物价格计算方式：总价=常规引物的价格+修饰价格。
• 如需周末送货，请与当地销售联系。
• 兼并引物对应：R=G+A 、Y=C+T 、K=G+T 、W=A+T 、S=C+G 、M=A+C 、B=C+G+T 、D=A+G+T 、H=A+C+T 、 V=A+C+G 、N=A+C+G+T

（二）修饰引物合成

修饰引物类别：

我们可以合成所有常见的修饰引物。我们合成的修饰引物全部采用HPLC纯化，确保引物序列准确性和更好的纯度。修饰引物的HPLC纯化不收取纯化费用。

修饰引物的价格=普通DNA 合成价格+修饰价格。

双标记引物合成：

引物常见问题：

Q-1、合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗?

A-1.溶液中的Oligo DNA常温下数天（3-4天）应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命受溶液中的菌体、核酸酶等的影响。

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Q-2、怎样理解测定的OD值?

A-2.进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200 ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为多少？此时的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。

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Q-3、怎样对合成的DNA制品进行定量?

A-3. DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。

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Q-4、合成Oligo DNA应怎样保存?

A-4.保存合成的Oligo应该注意以下几点： 

(1).干燥制品很稳定，常温下数个月无问题。但为保证万无一失，放置于-20℃保存为好。 

(2).溶解后的溶液DNA短期内（1-2周）使用可放置在4℃下保存，长期保存请放置于-20℃。溶解DNA时，请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer。

(3).荧光标记引物请避光保存。

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Q-5、制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗?

A-5.所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。

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Q-6、为什么PAGE级和高纯度级制品的提供量比其他公司少?  

A-6.无论是PAGE纯化，还是HPLC纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在2 OD左右。大OD量的提供对提高纯度是不现实，不科学的做法。一般，1 OD的20mer的DNA制品 (约5 nmol)，可以进行200-400 次的PCR反应 (50ml体系)，以及1,400次的测序反应。因此，2 OD 的DNA量可以足够进行一般的实验工作。

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Q-7、我公司的DNA制品包装中为什么不提供电泳照片? 

A-7.进行过Oligo DNA PAGE电泳的人员都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品电泳时的泳带亮度（清晰度）是不一样的。原因在于EB等染色剂的染色是渗透至DNA的双链之间的，而合成的Oligo DNA是单链，Oligo DNA自身形成的立体结构越复杂，EB的染色就越容易，DNA带也就越亮。相反，有一些Oligo DNA由于不形成立体结构，根本就不为EB所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供差不多同一亮度的制品的电泳照片是非常不现实的做法。

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Q-8、使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品，发现有很多条泳带，为什么?

A-8.Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。

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Q-9、进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

A-8.Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。

(1). A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；

(2). DNA的立体结构不同，电泳速度不同。这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。

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Q-10、PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，为什么?

(1). 合成机管路的瞬时阻堵，造成化学反应的瞬间中断，其结果可能会发生单个(或一部分)碱基的缺失。

(2). 计算机程序失灵，控制错误合成。

(3). 合成过程中，碱基附加至DNA片段之前，碱基和碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，造成多碱基现象。

(4). 合成时碱基G可能会转化成烯醇异构体，此时进行PCR反应时G会转变成A。

(5). 合成过程中的脱嘌呤作用，对脱嘌呤后的碱基DNA聚合酶不能识别，此时可能观察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易发生这种情况。

(6). 不完全的脱保护结果。通常C脱得快，G脱得慢。不完全脱保护会发生碱基缺失。

(7). 合成过程中的Capping（盖帽）反应不完全，使短片段DNA继续参与合成，造成碱基缺失。 应该说，上述这些情况发生的可能性都极低。然而，合成的DNA链越长，发生这种情况的机率也就越大。

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Q-11、PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?

A-11.(1). 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，也许结果会变好。

(2). 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。

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Q-12、进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办? 

A-12.(1). 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证，这是实验的常识。

(2). 我们可以免费重新合成引物。

(3). 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。

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Q-13、怎样才能保证Oligo DNA的正确性? 

A-13.(1). 合成Oligo DNA时，选用高纯度级制品。

(2). 避免使用大于50mer的长链Oligo DNA，最好选用小于35mer的合成DNA制品。

(3). 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。

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Q-14、Oligo DNA最长可以合成多少个碱基? 

A-14.以每步反应效率为99%进行计算，粗略计算合成到100个碱基时，目的DNA片段的比例便为0 (精确数为37.0%)，要想保证合成DNA的碱基100%正确，Oligo DNA的长度最好不要超过70mer，80mer以上要想保证一个碱基不错就非常危险了，须十分注意。

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Q-15、一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有Q吗? (Q为修饰) 

A-15.没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加Q，订货时请特别注明，此时需收取加Q (Q修饰) 的费用。

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Q-16、合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

A-16.PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

(1). 引物和模板是否配对，同源性有多大?

(2). 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构?

(3). PCR反应用试剂是否能正常工作?

(4). PCR仪是否工作正常?

(5). PCR反应条件是否合适?

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基因合成

依照某一蛋白质的氨基酸序列，或基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中。化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性和不同的实验需求，设计基因序列，提高表达水平。

实验流程

我们可以提供的服务

• 免费提供基因的参考设计方案；
• 酶切位点的设计、密码子的优化等；
• 可将合成的基因克隆到指定的载体上；
• 签订的基因合成服务协议和保密合同；

服务承诺

• 保证所合成的基因序列 100% 准确，并提供 DNA 测序结果；
• ≤3000bp的序列合成时间为5-15个工作日。
• 3000-5000bp的序列合成时间为10-20个工作日。
• ≥5000bp请咨询。

您需要准备的

• 请将您需要合成的基因序列及要求发送至我公司合成邮箱。
• 请务必留下您的联系方式，以便及时与您沟通。
• 如需连接到特殊指定载体，请您单独提供给我们。
• 如需我们做密码子优化服务，请提供以下信息。

基因合成价格

基因全长	价格	交货时间
最小订单	580元	5-10个工作日
<3000 bp	3.0元/bp	5-15个工作日
3001-5000 bp	3.5元/bp	10-20个工作日
>5000 bp	询价	需分析序列

备注：1.此价格为常规序列，如有复杂结构，价格会相应调整，回复订单时会邮件通知。 2.亚克隆需要单独收费500元/个。

提交的产品及资料

• 基因合成报告单。
• 测序图谱& 质粒结构图。
• 冻干质粒DNA一管（约5μg/管）。
• 含有相应质粒的甘油菌一管。

STR/SSR

微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列（STR: Short Tandem Repeat）或简单重复序列（SSR: Simple Sequence Repeat），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。

传统采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，费时费力效率很低。利用荧光标记的引物对STR位点进行扩增，采用DNA 测序仪对荧光标记片段和内标同步进行检测，可以使 STR 分型变得高效快捷，结果也更加精确。同样 AFLP 等其他遗传标记也可以借助这一技术来完成。我们以ABI 3730XL测序仪为检测平台，大幅度缩短你发现历程。

实验流程：

您需要提供的信息送样要求

样品信息：样品名称，样品类型，荧光标记类型及目标范围，是否混样及混样方式。

基因组DNA样品：DNA样品浓度≥50ng/ul,体积最少量为10ul并每增加一个位点增加2ul样品, A260/A280比值为1.8左右，送检DNA样品浓度稀释成相对一致。

血液样品：血液样本用EDTA抗凝剂的真空管采集或枸橼酸钠抗凝，采集后放入-20℃保存，体积大于1ml。

荧光PCR产物或酶切产物：体积≥10ul，琼脂糖电泳能看到目的条带，需避光保存。

我们可以提供的服务

• 按照您实验的要求,为您设计实验方案。包括：荧光标记的选择,设计与合成荧光引物，实验条件摸索，内标的选用等等。
• 根据所设计的实验方案用荧光引物完成PCR扩增。
• 在测序仪上完成电泳扫描 , 数据采集。
• 用 Genemapper4.0软件对收集到的数据进行处理分析 , 将产物片段大小、数量多少的信息转化成直观准确的分析图谱，并统计到Excel表格中，为您下一步进行关联分析或连锁分析等遗传分析提供数据可靠的数据。

结果展示

单检（FAM）:纯合子 单检（FAM）:杂合子 四色荧光混合检测（HEX+TAMRA+ROX+FAM） 片段分析（FAM）

服务价格

项目	内容	价格
基因组DNA提取	全血样品的基因组DNA提取	20元/样本
位点预实验	确定位点PCR反应条件	300元/位点
STR位点扩增	根据预实验条件批量扩增	5-10元/扩增
毛细管电泳检测	与500LIZ内标混合，上测序仪检测	700元/板
	与1200LIZ内标混合，上测序仪检测	1500元/板

服务说明

微卫星位点选择 : 由于有多态性的微卫星位点才可以提供有效的信息，因此在选取微卫星标记时，一定要选取杂合度高的位点，才能尽量多的获得有效的信息。

荧光标记选择 : 可以检测的荧光标记很多种，建议选取FAM（蓝色）,HEX（绿色）,ROX（红色）,TAMRA（黄色，软件显示黑色）。

微卫星位点混检: 混合检测请选用不同荧光标记。如同色荧光混合检测，非特异性扩增条带会影响检测结果。

SNP检测

核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指有单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态。SNP是继微卫星之后的第三代遗传标记。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究（如生物的起源、进化及迁移等方面）。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式，人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP，有些SNP位点还会影响基因的功能，对它的研究将帮助我们在疾病相关基因定位，认识人种、人群、个体间的遗传差异，研究基因组结构，研究疾病或耐药性与个体差异的关系等领域进行深入的了解。

项目内容

根据需要检测的SNP位点，设计实验方案，安排实验，分析结果整个过程。

我们公司可提供PCR测序法，SNaPshot方法对SNP进行分型。

（一）PCR测序检测

PCR测序是SNP分型的金标准，直接对需要检测的位点进行扩增后测序，通过PCR测序法进行SNP分型检出率几乎为100%。纯合型SNP位点的测序峰图为单一峰型，杂合型SNP位点的测序峰图为套峰。

实验流程

您需要提供的信息

NCBI基因登陆号和rs号或物种信息，SNP位点及上下游至少200bp基因组DNA序列，并尽可能标注出范围之内的其他SNP位点。

送样要求

基因组DNA样品：DNA样品浓度≥50ng/ul,体积最少量为10ul并每增加一个位点增加2ul样品, A260/A280比值为1.8左右，送检DNA样品浓度稀释成相对一致。 血液样品：血液样本用EDTA抗凝剂的真空管采集或枸橼酸钠抗凝，采集后放入-20℃保存，体积大于1ml。

我们可以提供的服务

• 根据需检测的SNP位点,设计引物。
• 优化及确定PCR扩增条件。
• PCR纯化后安排测序。
• 根据测序结果对SNP位点分型。

结果展示

服务价格

项目	内容	价格
基因组DNA提取	全血样品的基因组DNA提取	20元/样本
位点预实验	确定位点PCR反应条件	200元/位点
位点扩增	根据预实验条件批量扩增	5-10元/扩增
测序检测	PCR纯化后安排测序	同常规测序

（二）SNaPshot检测PCR测序检测

该系统也采用ABI 3730xl DNA测序仪，该技术也称小测序技术，适合≧6个SNP位点的检测。该检测方法的主要原理为单碱基延伸技术。即在紧邻SNP位点的地方设计引物，反应时加入SNP位点引物，扩增出的带有SNP位点的PCR产物，带荧光标记的ddNTP，通过单碱基延伸后引物带上SNP位点碱基相关的荧光，随后将反应产物在ABI 3730xl测序仪上分析后，就能得到SNP位点的信息。该方法一个反应就能检测多个SNP位点，在充分利用测序法准确直观的优点的同时，增加了一次反应检测的位点数，极大地降低了实验成本。

• 直接检测出位点碱基信息，检测结果直观准确。
• 一次检测多个位点，96个样品，适合中到大型SNP分型项目。
• 应用灵活。可以根据需要灵活定制实验方案，检测基因组中任意位置的SNP位点，甚至可以将不同物种的基因组放在一起进行检测。
• 检测费用相对较低。

实验流程

我们可以提供的服务

• 按照您的要求, 为您设计实验方案, 包括PCR引物的设计及合成，SNP位点引物的设计及合成，荧光分子量 Marker 的选用等等。
• 所设计的实验方案完成荧光单碱基延伸PCR ，并在测序仪上完成电泳扫描 , 数据采集。
• 用 Genemapper4.0 软件对收集到的数据进行处理分析 ,为您下一步进行关联分析或连锁分析等遗传分析提供数据可靠的数据。
• 提交结果方式：分型表格一份，分型峰图一份。

检测峰的位置代表SNP位点，峰的颜色代表不同SNP型别

服务价格

项目	内容	价格
基因组DNA提取	全血样品的基因组DNA提取	20元/样本
SNaPshot分型	引物设计及合成	12元/位点/样品 （包含所有费用）
	实验条件摸索及优化
	PCR扩增及纯化
	SNaPshot延伸
	上机检测及结果分析

备注：需要同时满足 位点数≥6个,样品数≥100个。

基因检测

利用特异的引物对感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行特异性扩增后进行测序分析。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

基因检测常用于以下研究

• 同物种间不同个体的差异检测。
• DNA序列的突变、缺失、插入与表型的关联性研究。
• 单基因遗传病。
• 复杂疾病的致病基因研究。
• 药物敏感性分析。
• 菌种鉴定......

实验流程

您需要提供的信息

您的检测要求及提供详细的背景资料，送检样品的相关信息，物种信息，需检测的目标基因组DNA序列。

送样要求

基因组DNA样品、cDNA、质粒：DNA样品浓度≥50ng/ul,体积最少量为10ul并每增加一个位点增加2ul样品, A260/A280比值为1.8左右，送检DNA样品浓度稀释成相对一致。

血液样品：血液样本用EDTA抗凝剂的真空管采集或枸橼酸钠抗凝，采集后放入-20℃保存，体积大于1ml。

我们可以提供的服务

• 对提供的样品质检。
• 根据需检测的目标DNA序列设计的实验方案。
• 设计及合成实验需要的引物。
• 在以基因组DNA、cDNA、质粒、为模板PCR扩增目的片段，并安排测序。
• 针对测序结果进行分析。

服务价格

项目	内容	价格
基因组DNA提取	全血样品的基因组DNA提取	20元/样本
位点检测	确定位点PCR反应条件	300元/500bp
PCR扩增	根据预实验条件批量扩增	5-10元/扩增
测序	安排测序实验	同常规测序

服务说明

实验结果仅用于科研。

如需返还PCR产物，请在订单注明。

TA克隆

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与T载体DNA连接起来的方法。 通过PCR的方法扩增目的基因片断，往往由于缺失或其他原因无法获得准确的DNA序列，通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，使用通用引物测出准确DNA序列。 由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：

（1）使用Taq酶，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。

（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

实验流程

您需要提供的信息

写明需克隆片段的信息：样品名称，片段大小，是否纯化，产物是否带有“A”尾。

送样要求

样品类型	片段长度（bp）	浓度	体积
PCR已纯化	100～3000	≥10 ng/ul	≥10 ul
PCR未纯化	100～3000	≥30 ng/ul	≥30 ul

我们可以提供的服务

• PCR产物鉴定及纯化。
• 使用我们公司pClone007 Vector Kit进行克隆。
• 测序及结果分析。

结果展示

服务价格

项目内容	价格
TA克隆	300元/样本
测序	同常规测序

备注：克隆费用是针对100-3000bp制定，如超过此范围，具体价格请垂询

我们可以提供的服务

• PCR产物鉴定及纯化。
• 使用我们公司pClone007 Vector Kit进行克隆。
• 测序及结果分析。

16S rDNA菌种

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基Rrna(16S rRNA)的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因组中。16S rDNA分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用，最有用的“分子钟”。其序列包含9个可变区（variable region）和10个恒定区（constant region）。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。16S rDNA的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。

采用测序方法对各种细菌的16S rDNA进行了广泛的研究，获得了大量的16S rDNA序列信息，并汇集到NCBI数据库中。将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行Blas比对，即可获知与该序列同源性较高的已知序列，为确定菌种的分类学地位提供依据。

实验流程

送样要求

1. 基因组DNA样品，请确保浓度≥ 10ng/ul，总体积≥10ul，A260/A280比值为1.8左右。

2. 除基因组DNA样品外，仅接收培养过的菌液, 体积≥ 1ml，请确保您提供的样品经过平板或斜面上的单菌落分离。因实验样品不纯造成的测序套峰，我们将收取全额的实验费用。

3. 若提供的菌株为革兰氏阳性菌，建议您提供基因组DNA。

4. 我们不接受具有致病性的样品。如果您的菌株带有致病性，请提供菌株的基因组DNA，并对其进行处理以灭活致病菌。

我们可以提供的服务

• 提取细菌基因组DNA。
• 扩增16S rDNA序列，约1500bp左右。
• PCR纯化后安排测序。
• 根据测序结果得到的序列上NCBI比对。

服务价格

项目内容	样品类型	价格
细菌16S rDNA菌种鉴定	基因组DNA	200元/样本
	菌液	300元/样本

提供结果

1.测序峰图文件及序列文件。

2.分析及比对情况。

服务说明

1．送测菌液样品应在平板或斜面至少分离三次以上的单菌落培养。

2．若无法培养分析的细菌，可以采用连入T载体后挑取多个单菌落测序。